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层析柱柱效测定



666,如何给你的层析柱测出10000+的柱效?


柱效,从名字上理解即层析柱的分离效果。层析柱的有效塔板数越大或有效的塔板高度越低,色谱柱的柱效越好。




理论塔板数(HETP)

根据塔板理论,可以计算一根色谱柱所达到的理论塔板数,或表达为每米理论塔板数n/m。把相当于一个理论塔板的柱子长度称作理论塔板高度H,通常采用有效塔板数N和有效塔板高度L来表达柱效,W为峰宽,W1/2为半峰宽:

N=16(TR/W)2

=5.54(TR/W1/2)2

=L/H

显然,N值越大,或H值越小,柱效越高。


柱效主要取决于所选择的填料(即固定相),但是我们常常在使用过程中发现:同一批次填料相同规格的根层析柱,外观一模一样,柱效却截然不同;同一批次填料,同一层析柱前后两次装填,柱效依然不同。究其根源,是装柱的问题

层析柱的装填质量无论是在确保纯化过程的稳定性还是保障最终产物的安全性上都是极为重要的一环。汉邦科技ACC系列全自动轴向压缩层析柱配套自动装柱工作站,全自动智能化的装柱方式能够保证每次装填效果一致及层析结果可重复;科学的分配器结构设计,料液分布均匀,也是提高柱效的一大法宝。即便有如此好的层析柱,也需要合适的柱效测定方法,才能测出高柱效!




层析柱柱效测定方法


本方法适用于所有中低压液相色谱的预装柱及自己填装的层析柱。

介绍分为5个部分,测前准备、试剂选择、测柱效操作、测试结果积分、经常发生的问题。


1. 测前准备:

⑴层析系统。要求系统的型号与层析柱大小匹配,从上样阀门到紫外和电导检测器之间的体积要做到最小(管路内径尽量细,管路尽量短),这对于准确测量实验室小层析柱的柱效非常重要。

⑵测试平衡溶液及样品。

⑶装填好的层析柱。使用平衡缓冲液在测柱效的流速下至少平衡1.5 CV (柱体

积),平衡方向与测柱效方向必须一致。

⑷进样环。容积大于1%柱体积。


2. 试剂选择

测柱效主要有两种测试方式: NaCl 测试 和 丙酮测试。只要操作正确,两种方式测量的结果基本一致。但是要注意:各试剂的浓度不能随意更改,否则影响测试结果。

⑴ NaCl 测试

对于所有种类的柱子和填料,都可以使用氯化钠测柱效

平衡液: 0.4 M NaCl 水溶液

样品: 0.8 M NaCl 水溶液

(2)丙酮测试

对于亲和、离子交换和凝胶过滤技术的层析柱和填料

平衡液: 水

样品: 1%丙酮的水溶液

对于反相和疏水层析柱和填料

平衡液: 20%乙醇

样品: 1%丙酮溶于20%乙醇


3. 测柱效操作

测柱效全程使用30 cm/h 线性流速。平衡层析柱需要至少1.5倍柱体积(CV)的平衡液 ,将1% CV的样品(NaCl 或丙酮)注射进入层析柱,使用平衡液冲洗直至电导或紫外280nm出现响应峰。


4. 测试结果

软件工作站自动对响应峰积分,读取积分结果理论塔板数(HETP)与对称性(Asymmetry)。

注:NaCl 测试的积分曲线为电导曲线,丙酮测试的积分曲线为280nm处的UV曲线。

Peak data 区域中将会显示增选的分析结果判断层析柱柱效是否合格的标准是Plates per meter 和Asymmetry。Plates per meter 要求大于说明书上要求的最低限(如 >3000 或20000),或者>1000000/平均粒径/3 ( 计算出来就是说明书上的值) 。Asymmetry要求处于0.8~1.8 之间。满足这两点,说明柱子装填没问题。







影响柱效的原因与对策


如果不幸你测出来的柱效不合格,可能是以下原因导致的,小编在此附上解决对策:

❎ 柱子装填不均匀----重新装柱

❎ 管道中液流不稳定----NaOH清洗系统;平衡柱子1.5CV 以上

❎ 柱子中有气泡----溶液脱气;反压阀在线,冲洗足够长时间

❎ 凝胶有结块现象----拆掉层析柱, NaOH清洗凝胶后重新装柱;换新的凝胶

❎ 柱子液流分配不好----换分配器或层析柱

❎ 系统死体积大----换细管路;短接柱位阀

❎ 样品体积太大----上1%柱体积

❎ 流速太快----根据使用的流速来测